Resultado Proyecto
Identificación de biomarcadores de calidad en la carne relacionados con el estrés celular ante- y peri-sacrificio
Referencia: AGL2011-30598-C03-03. Organismo financiador: Ministerio de Ciencia e Innovación. Importe: 96.800 €. Duración: 2011-2015.
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Equipo investigador
Mª Carmen Oliván García. SERIDA
Pedro Castro Alonso. SERIDA
Miguel Ángel Fernández Lazcano. SERIDA
María Josefa Rodríguez Colunga. Universidad de Oviedo
Pelayo González González. ASINCAR
Kristin Hollung. NOFIMA Mat (Noruega)
Resultados y conclusiones
Se trata de un proyecto coordinado en el que han participado tres instituciones (SERIDA, IRTA y UAB). El objetivo general fue mejorar el conocimiento existente sobre el bienestar animal en granja y matadero, y su relación con la calidad de la carne en porcino, desarrollando medidas individuales (comportamiento, fisiológicas, bioquímicas) para la detección de situaciones de estrés.
Las actividades del grupo liderado por el SERIDA (Subproyecto 3) se centraron en la identificación de biomarcadores de estrés en la carne, organizándose las tareas en base a dos objetivos principales:
1) Estudiar los cambios celulares, bioquímicos y moleculares que ocurren en el proceso de conversión del músculo en carne asociados al estado emocional de los animales y su bienestar
• Efecto de la mezcla de animales en granja y/o durante el transporte y espera en matadero: Los resultados mostraron que la mezcla de animales extraños provoca estrés animal, lo cual produce un incremento del estrés oxidativo muscular y activa la autofagia como estrategia adaptativa para contrarrestar dicho estrés.
• Efecto del sesgo cognitivo sobre el metabolismo muscular post-mortem: Los resultados indican que las variaciones en el comportamiento animal, caracterizado mediante el test del sesgo cognitivo, se correlacionan significativamente con diferencias en el estrés oxidativo muscular y en los niveles de dopamina y serotonina cerebral tras el sacrificio. Los cerdos con sesgo cognitivo negativo fueron más susceptibles al estrés, mostrando procesos proteolíticos en el músculo más intensos y activación temprana de mecanismos de supervivencia celular (capacidad antioxidante, actividad el proteasoma y autofagia) con el fin de combatir el incremento inducido de estrés oxidativo.
• Efecto del sexo (machos vs hembras) y la mutación del gen halotano RYR1 (NN vs Nn) sobre el estrés oxidativo y las proteínas involucradas en la contracción muscular. El músculo de las hembras mostró niveles de oxidación lipídica (LPO) inferiores a los machos, lo cual puede deberse a la protección por estrógenos. En ambos sexos, la LPO se elevó a medida que avanzaba la maduración post-mortem. La actividad antioxidante total (AAT), indicador de los niveles antioxidantes del tejido, fue mayor en machos que en hembras, posiblemente como respuesta al mayor estado oxidativo del músculo.
Partiendo de la hipótesis de que el estrés induce un incremento en la actividad metabólica, que llevaría acompañado un aumento de la contracción muscular, y que este fenómeno sería más agudo en los animales con la mutación RYR1, se estudió mediante PCR cuantitativa cómo varía la expresión génica de las principales moléculas implicadas en el disparo de la contracción muscular mediante la liberación de calcio del retículo endoplásmico (RyR1 y su regulador la Calstabina, que constituyen el canal de liberación de calcio) y posterior recuperación de dichos iones por el retículo sarcoplásmico (SERCA). Los resultados del estudio mostraron mayor nivel transcripcional de RYR1 en el músculo de los machos en comparación con las hembras, independientemente de portar o no la mutación, debido probablemente a que los machos son capaces de producir mayor nivel de contracción de sus fibras musculares. Además, se observó que la Calstabina se transcribe de forma inversa a la Ryanodina (RyR1).
En el caso de la transcripción de SERCA, que precisa ATP para funcionar, se observa un nivel de transcripción inferior en los individuos machos, especialmente los portadores, comparados con las hembras, muy probablemente debido a que la reserva energética en los machos se reduce más rápidamente que en las hembras, tanto por el papel protector de los estrógenos como por la reserva mitocondrial que la hembra aún posee, debido a su menor contractabilidad y actividad metabólica.
• Efecto del manejo en granja (indoor vs outdoor) y en el transporte. Se encontraron diferencias significativas en el metabolismo muscular post-mortem debido al manejo en granja (extensivo vs intensivo) y en el transporte al matadero (largo y rudo vs corto y suave). Así, los animales criados en extensivo presentaron mayor AAT en el músculo en el momento del sacrificio, aunque esta situación no pudo contrarrestar un mayor daño lipídico (LPO) a las 24h post-mortem. El mismo efecto se observó al comparar los animales sometidos a transporte largo (mayor AAT 0h, mayor LPO 24h) frente al corto. Estos parámetros parecen indicar mayor estrés pre-sacrificio en los animales criados en extensivo y en los animales que sufrieron un transporte más largo y duro.
• Efecto del tipo de alojamiento: EMPOBRECIDO (animales criados en un medio sin paja y mayor densidad en el cubículo) vs ENRIQUECIDO (animales criados en un medio enriquecido con paja y menor densidad) Se encontró un efecto significativo del tipo de alojamiento sobre la AAT 0h en el músculo (mayor en los animales del medio enriquecido, incremento con el tiempo post-mortem) y en el LPO, aunque no se detectaron diferencias en la actividad de enzimas antioxidantes, como Superóxido Dismutasa (SOD) y Catalasa (CAT). Sí hubo un efecto significativo de las condiciones de alojamiento sobre los marcadores de autofagia, con mayor presencia de Beclin 1 y mayor ratio LC3II/LC3I en el músculo de los cerdos criados en medio enriquecido, lo cual indica una activación más temprana de la autofagia.
2) Identificar biomarcadores de calidad de la carne relacionados con los mecanismos que ocurren en el músculo en el post-mortem temprano y que podrían reflejar estados de estrés ante- y peri-sacrificio.
• Efecto de la mezcla de animales en granja y/o durante el transporte y espera en matadero. Los resultados mostraron que los tratamientos de mezcla (estrés) provocaron cambios en algunas proteínas musculares claves, como la heat shock 70kDa protein-1B “HSP70-1B”, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa “GAPDH”, la lactato deshidrogenasa-A “LDH-A” y la adenilato-kinasa isoenzyme-1 “AK-1”. Además, la detección de determinados metabolitos encontrados en el suero en el momento del sacrificio relacionados con el metabolismo de las grasas (LDL-colesterol y triglicéridos) y de cambios en proteínas musculares relacionados con el metabolismo de los adenin-nucleótidos (AK-1) y la regulación glicolítica (piruvato kinasa y GAPDH) permitieron discriminar correctamente las muestras de carne según el tratamiento del que procedían (“mezcla” o “no mezcla”).
• Efecto del sexo (machos vs hembras) y la mutación del gen halotano (RYR1) sobre los cambios del perfil electroforético del extracto sarcoplásmico muscular. Los resultados mostraron que el sexo afecta a la presencia de varias proteínas sarcoplásmicas, como la myosin-binding protein C fast type “Fast MyBP-C”, con mayor presencia en las hembras (P<0.05) y la 6-fosfofructokinasa “PFKM”, con mayores niveles en los machos (P<0.01). Además, el gen halotano (la mutación RYR1) redujo la presencia de varias proteínas en el músculo, como la Fast MyBP-C (P<0.05), la GAPDH (P<0.01) y la anhidrasa carbónica III “CAIII” (P<0.05) e incrementó β-enolase “ENO3” (P<0.05). Estos resultados resaltan diferencias significativas de la composición de las fibras, la defensa antioxidante y la ruta glicolítica muscular post-mortem, y por ello son potenciales biomarcadores individuales de estrés.
• Efecto del tiempo post-mortem (0h-4h-8h-24h) sobre el perfil electroforético del extracto sarcoplásmico muscular. Se observaron cambios significativos en algunas proteínas relevantes, mostrando evolución ascendente la fructosa-bisfosfato aldolasa-A “ALDOA” (P<0.05) y descendente la glucógeno fosforilasa “GP” (P<0.05) y la PFKM (P<0.05), entre otras. Se analizaron las correlaciones entre el proteoma analizado a distintos tiempos post-mortem y las variables fisiológicas determinadas en la sangre en el momento del sacrificio y de calidad de la carne registradas en matadero, encontrándose el mayor número de correlaciones significativas a las 4 h post-mortem. Con todo ello, podemos concluir que el tiempo óptimo de muestreo del tejido muscular para detectar biomarcadores proteómicos es a las 4h post-mortem, tanto para detectar situaciones de estrés como para predecir la calidad final de la carne.
• Efecto del manejo en granja (indoor vs outdoor) y transporte. Se encontraron diferencias significativas en el proteoma muscular debido al manejo en granja (indoor vs outdoor) y en el transporte al matadero (largo y rudo vs corto y suave). Se detectó mayor susceptibilidad al estrés en los animales criados en sistema extensivo o “outdoor”, es decir, con salida diaria al exterior, que mostraron mayor nivel del complejo TCP1-β en el músculo. Además, los animales sometidos al transporte largo y rudo mostraron mayor estrés y cambios en proteínas musculares relacionadas con el metabolismo glicolítico post-mortem (ENO3 y LDH).
• Efecto del tipo de alojamiento: EMPOBRECIDO (animales criados en un medio sin paja y mayor densidad en el cubículo) vs ENRIQUECIDO (animales criados en un medio enriquecido con paja y menor densidad) sobre los cambios post-mortem del proteoma muscular. No hubo interacción significativa entre el tipo de alojamiento y el tiempo post-mortem para ninguna de las proteínas estudiadas. En el global de los datos, el tipo de alojamiento influyó significativamente sobre la proteína “Fast MyBP-C”, con mayor presencia en el músculo de los animales criados en el sistema enriquecido (P<0.01), lo que indicaría un efecto del tipo de alojamiento sobre la estructura miofibrilar. También se observó un efecto del alojamiento sobre la expresión de ENO3, que presentó mayor nivel de fragmentación en los animales del sistema enriquecido. También se detectaron mayores niveles de la proteína LDH en el músculo de los cerdos criados en el sistema enriquecido (P<0.05). Todo esto parece mostrar una glicolisis muscular post-mortem acelerada en los cerdos procedentes del alojamiento enriquecido y con menor densidad animal, lo cual indicaría mayor susceptibilidad al estrés en este grupo.
CONCLUSIONES GENERAL:
En general, los datos obtenidos indican efectos significativos de ciertos factores pre-sacrificio (sesgo cognitivo, sexo, mutación del gen halotano, manejo por el hombre, tipo de alojamiento, tipo de transporte) sobre el estrés animal, lo cual afecta al proceso de conversión del músculo en carne, alterando parámetros bioquímicos y proteómicos que pueden detectarse en el músculo post-mortem y por lo tanto son potenciales biomarcadores de estrés para la industria cárnica.
El análisis conjunto de los resultados nos permite proponer una batería de potenciales biomarcadores de estrés, que se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1: Biomarcadores de estrés identificados en los distintos experimentos realizados en el proyecto.
