Resultado Proyecto
Nuevas vías para el tratamiento de infecciones sistémicas en acuicultura
Organismo financiador: Ministerio de Medio Ambiente, Rural y Marino (Planes Nacionales de Acuicultura Continental). Importe: 50.422 €. Duración: 2005-2008.
Equipo investigador
Isabel Márquez Llano-Ponte SERIDA
José Miguel Prieto Martín SERIDA
Rosa Casais Goyos SERIDA
Ana Del Cerro Arrieta SERIDA
José Luis Múzquiz Moracho Universidad de Zaragoza
Entidad Colaboradora
Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza
Resultados
El objetivo inicial del proyecto fue encontrar nuevas vías para el tratamiento de infecciones sistémicas en acuicultura, particularmente frente a tres importantes enfermedades bacterianas que afectan a los salmónidos, tanto de cultivo como de poblaciones salvajes. En concreto, los objetivos fueron: 1.- Caracterizar molecularmente los agentes causales de los brotes registrados de forunculosis, síndrome del alevín y lactococosis. 2.- Obtener un banco de cepas de las tres bacterias a partir de distintas especies de salmónidos (Salmo salar, Oncorhynchus mykiss y Salmo trutta) en las comunidades autónomas de Aragón, Asturias, La Rioja y Navarra, tanto en piscifactorías como en ríos. 3.- Tipificación genética de cepas probióticas seleccionadas. 4.- Evaluar el efecto in vivo de las cepas seleccionadas al desafiarlas con cepas patógenas de A. salmonicida, Fl. psycrophilum y L. garvieae, observando supervivencia y colonización. 5.- Evaluación in vivo de cepas probióticas frente a las bacterias caracterizadas molecularmente.
A lo largo del proyecto se ha ido optimizando la recuperación de F. psychrophilum a partir de peces enfermos, de manera que prácticamente en todos los brotes positivos por PCR se aisló el patógeno por microbiología clásica. Esto, junto con el incremento de los brotes en los últimos dos años, explicaría el crecimiento del número de cepas obtenidas de esta especie. Por el contrario, la utilización de vacunas para combatir la lactococosis nos ha impedido la colección de un número de cepas de L. garvieae suficientemente amplio para realizar análisis estadísticos significativos.
El uso indiscriminado de oxitetraciclina (OTC) en la acuicultura ha conducido al incremento de cepas resistentes a este producto (más del 80% de las cepas estudiadas), lo que ha conducido a la utilización de otros productos como el florfenicol (FLO). Sin embargo, a pesar de que las cepas de F. psychrophilum no son resistentes al FLO, algunas de ellas presentan concentraciones mínimas inhibitorias (CMIs) ligeramente por encima de la media, lo que apunta a posibles problemas de resistencia en un futuro. Por ello, es necesario mantener sistemas de vigilancia epidemiológica sobre la evolución de estas resistencias, así como ahondar en el conocimiento de los mecanismos de resistencia en esta especie.
La amplificación al azar de ADN (RAPD) ha resultado ser una herramienta poco discriminatoria en la caracterización de las diferentes especies de este estudio, mientras que la electroforesis en campo pulsante (PFGE) ha resultado ser mucho más útil, con unos resultados más reproducibles y discriminatorios. En el caso de A. salmonicida, nos ha permitido diferenciar, dentro del RAPD-tipo predominante, ocho PFGE-tipos diferentes. Todos los PFGE-tipos obtenidos mostraron un patrón de bandas similar, lo que confirma la homogeneidad de este grupo de microorganismos, que ya había sido descrita por otros autores.
El análisis de F. psychrophilum mediante PFGE, mostró la gran heterogeneidad presente dentro de esta especie, ya que los 16 PFGE-tipos obtenidos fueron agrupados en cuatro grupos genómicos con más de un 80 % de similitud entre ellos y seis ramas independientes. Además, algunos de estos tipos eran exclusivos de determinadas zonas geográficas o de piscifactorías concretas. También, se observaron diferentes tipos genómicos en una misma piscifactoría o incluso en un mismo brote.
Figura 1. Para la tipificación de flavobacterium mediante electroforesis en campo pulsante, inicialmente se ensayaron 16 enzimas de restricción diferentes, y los mejores resultados se obtuvieron con StuI, que fue el que se utilizó para analizar todas las cepas, utilizando las condiciones de electroforesis que aparecen en la figura. Una cepa se consideraba diferente si su perfil difería en una o más bandas de tamaño mayor de 100 kb. Con este criterio se obtuvieron un total de ocho perfiles diferentes para las 13 cepas procedentes de brotes, que se agruparon en cuatro grupos genómicos diferentes, por lo que resultó ser una técnica más discriminativa que la anterior. La mayoría de las cepas analizadas (6) pertenecían al grupo genómico II y fueron aisladas en zonas geográficas diversas.
La tipificación genética de las cepas probióticas seleccionadas, así como su efecto in vivo, corrió a cargo del equipo de la Universidad de Zaragoza. Se demostró que Lactococcus lactis subsp lactis CLFP 100 y Lactoconostoc mesenteroides CLFP 196 son las cepas más adecuadas para su aplicación oral como probiótico frente a la forunculosis (Aeromona salmonicida). Leuconostoc mesenteroides CLFP 196 y Lactobacillus plantarum CLFP 238, han demostrado ser las cepas más adecuadas para su aplicación oral como probiótico frente a la lactococosis de la trucha. Queda pendiente por realizar las pruebas con F. psychrophilum, que es una línea de investigación en la que se trabaja en la actualidad.