Resultado Proyecto
Interacciones entre el embrión bovino y el útero durante la transición de mórula a blastocisto
Referencia: AGL2008-01530/GAN. Organismo financiador: Ministerio de Ciencia e Innovación. Importe: 30.250 €. Duración: 2008-2009.
Equipo investigador
Enrique Gómez Piñeiro SERIDA
José Néstor Caamaño Gualdoni SERIDA
Mª del Carmen Díez Monforte SERIDA
Marta Muñoz Llamosas SERIDA
Silvia Pérez López HUCA
Beatriz Trigal Triguero SERIDA (Alta 2009)
Fernando Corrales Universidad de Navarra (Alta 2009)
Equipo técnico
Susana Carrocera Costa SERIDA
David Martín González SERIDA (Alta 2009)
José Manuel Prendes García Cooperativa de Agricultores de Gijón
Juan José Pérez Jánez Cooperativa de Agricultores de Gijón
Juan Moreno Roa Sexing Technologies EEUU
Entidades Colaboradoras
Asturiana de Control Lechero (ASCOL)
Asociación de Criadores de Gochu Asturcelta (ACGA)
Asociación de Criadores de Oveya Xalda de Asturias (ACOXA)
Asociación de Criadores de Cabra de la Raza Bermeya (ACRIBER)
Centro de Fertilización In vitro de Asturias
Resultados y conclusiones
El objetivo del proyecto es utilizar las proteínas expresadas diferencialmente en el útero para mejorar la eficiencia de los cultivos in vitro y la salud de los animales nacidos. Las tareas realizadas fueron las siguientes:
Selección de receptoras por su aptitud para la recogida de fluido uterino (FU) y embriones.
A partir de un rebaño de 25 receptoras, se ha analizado la capacidad de las mismas para sostener el desarrollo de embriones desde día 4 hasta día 8, período objeto de análisis en el proyecto. Las receptoras con menor capacidad reproductiva se descartaron y se ha conformado un rebaño cuyos animales presentaron facilidad de manipulación ginecológica, buena respuesta a la sincronización y capacidad de producir los resultados esperados. Se transfirieron entre 50-120 embriones producidos in vitro en día 4 (estadios 5-8 y 8-16 células) al útero de receptoras sincronizadas. Las receptoras que no fueron transferidas recibieron solamente un medio de cultivo (falsa transferencia). En día 8 se recobraron los embriones con FU, o bien solamente el FU (figura 1).
Figura 1. Recogida de fluido uterino
Todas las muestras (embriones y FU) se almacenaron a -80º C hasta su análisis proteómico. Los tratamientos se repitieron cada 2-3 meses y cada receptora se trató en cuadrado latino, recibiendo o no embriones. Según los embriones recobrados se dan tres tipos de respuesta en las receptoras: 1/ algún embrión recobrado está vivo; 2/ ningún embrión recobrado está vivo; 3/ no se recobran embriones.
Análisis del Proteoma.
Los análisis del proteoma de las muestras se están efectuando mediante Electroforesis Diferencial Bidimensional acoplado a espectrometría de masas (DiGE-MS) con la técnica de saturación de residuos de cisteína, la cual permite una alta sensibilidad y capacidad de detección de proteínas a baja concentración. Se han puesto a punto dos tipos de análisis:
DiGE con FU. Se analiza el proteoma del FU de modo diferencial para distinguir proteínas que pueden ser producidas por el útero materno en presencia de embriones. En todas las muestras de FU, analizadas hasta el momento, la concentración de proteína (mini-Bradford; 240 µg mínimo de proteína/alícuota) ha sido suficiente para realizar los análisis DiGE-MS de acuerdo con las expectativas del proyecto.
La resolución de los geles es muy buena y se han detectado en torno a 3.600 spots de proteína. Hemos podido encontrar e identificar hasta 35 proteínas expresadas diferencialmente entre FU procedente de embriones vivos y FU procedente de FT
DiGE con embriones (en minigel). La técnica es más complicada que con FU, puesto que requiere un paso previo adicional con un tampón de lisis, y además la escasa cantidad de proteína disponible en embriones es un factor limitante.
Se ha conseguido poner a punto la técnica a partir de 0,5 µg de proteína, cantidad contenida en 15-20 ovocitos/mórulas. Se ensayaron seis protocolos de DiGE, obteniéndose en todos los casos geles de muy buena calidad que contenían entre 3.700 y 4.000 spots.
Los objetivos alcanzados fueron los siguientes:
1/ Puesta a punto de un método eficiente para recoger proteínas del fluido uterino manteniendo una alta calidad en el material recogido.
2/ Optimización del análisis DiGE en fluido uterino bovino y en muestras de ovocitos y embriones (baja concentración de proteína).
3/ Identificación preliminar, por espectrometría de masas, de proteínas bovinas expresadas diferencialmente en el fluido uterino en presencia y en ausencia de embriones.