Equipo investigador
Carmen Díez Monforte. SERIDA
Enrique Gómez Piñeiro. SERIDA
Marta Muñoz Llamosas. SERIDA
Paloma Duque Álvarez. CEFIVA
Carlos Ochoa García del Fresno. CEFIVA
Equipo técnico
Susana Carrocera Costa SERIDA
Entidades Colaboradoras
Luis José Royo Martín. SERIDA
Csaba Pribenszky. Department of Animal Husbandry and Genetics, Faculty of Veterinary Sciences of Budapest (Hungría)
Para el estudio de los efectos del tratamiento de alta presión hidrostática (HHP) sobre la crio-sensibilidad de los ovocitos, complejos cumulus-ovocito bovinos procedentes de matadero y madurados in vitro (MIV) durante 22 h, se sometieron a un tratamiento de presión de 20 MPa, durante 1 hora a 27º C. Tras 1 h de recuperación, se vitrificaron por el método de fiberplugs. Tras la desvitrificación, los ovocitos se evaluaron morfológicamente y se sometieron a fecundación in vitro (FIV) o a activación partenogenética y se cultivaron para evaluar su capacidad de desarrollo. Se analizó asimismo la expresión de Heat Shock Proteins (Hsp70 y Hsp 90) en ovocitos.
Aunque la vitrificación redujo significativamente la capacidad de desarrollo de los ovocitos, la vitrificación con fiberplugs posibilitó una rápida manipulación de las muestras y disminuyó la relación volumen de solución/número de especímenes vitrificados, lo que mejoró las tasas de supervivencia con relación a la técnica Open Pulled Straw. No obstante, el tratamiento de los ovocitos con HHP no mejoró su supervivencia a la vitrificación tras FIV o activación partenogenética.
Con el fin de poner a punto la metodología adecuada para determinar si la aplicación de altas presiones favorece la síntesis de las Hsp (Hsp70 y Hsp 90) en los ovocitos, se analizó la expresión de las citadas proteínas por técnicas de western blot (WB) e inmunocitoquímica (ICQ). Para ello, fue precisa la adaptación de protocolos convencionales de WB a los diferentes tipos de muestras y condiciones experimentales. Gracias a estos trabajos hemos establecido una serie de parámetros (número de ovocitos/muestra, dilución de anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios) fundamentales para realizar el análisis de expresión de las Hsp en ovocitos. También se ha establecido el protocolo para cuantificar los resultados obtenidos de WB, mediante el uso del programa de procesamiento de imágenes ImageJ. Además, con el fin de establecer el patrón de distribución espacial de las proteínas Hsp en las muestras, se han adaptado protocolos de inmunocitoquímica tradicionales.
Los resultados preliminares obtenidos confirman los resultados obtenidos mediante WB, que parecen indicar la existencia de una expresión diferencial de Hsp70 en los ovocitos tratados con HHP y sus respectivos controles no tratados.