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Utilización de semen sexado para la mejora de las biotecnologías reproductivas in vitro en ganado vacuno

Referencia: RTA2008-00082-00-00. Organismo financiador: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria. Importe: 71.640 €. Duración: 2008-2011.

Equipo investigador

Carmen Díez Monforte. SERIDA
Enrique Gómez Piñeiro. SERIDA
José Néstor Caamaño Gualdoni. SERIDA
Marta Muñoz Llamosas. SERIDA
Fernando Vicente Mainar. SERIDA
Alfredo Castro. Sexing Technologies
David Cran. Sexing Technologies
Richard Lenz. Sexing Technologies

Equipo técnico

Susana Carrocera Costa. SERIDA

Entidades Colaboradoras

Luis José Royo Martín. SERIDA
Alfonso Gutiérrez-Adán. INIA
Sexing Technologies, USA

Justificación

Se pretende integrar la utilización del semen sexado bovino en las tecnologías reproductivas in vitro, con el fin de incorporar su utilización en el marco de los programas de mejora genética que se encuentran en marcha en España.

Para ello, se definirán las condiciones óptimas de utilización del semen sexado en combinación con la tecnología de producción de embriones in vitro (a partir de ovarios de matadero o de ovocitos recuperados por la técnica de Ovum Pick-Up –OPU-). Se analizarán los efectos que la separación espermática por citometría de flujo puede producir en los espermatozoides y su posterior capacidad para la producción de embriones in vitro. Y se abordará el análisis del método más favorable de separación espermática, fecundación y posterior sistema de cultivo, para integrarlo en los sistemas de producción de embriones in vitro. También, se analizarán las posibles interacciones entre los sistemas de cultivo utilizados y el sexo de los embriones, por lo que se estudiará el porcentaje de blastocistos obtenidos a partir de ovarios de matadero y de hembras vivas, estimando la calidad de los blastocistos obtenidos en términos de supervivencia a la vitrificación, número de células e índices de apoptosis. Finalmente, se valorarán los índices de gestación post-transferencia de los embriones obtenidos in vitro con semen sexado, tanto en fresco como tras vitrificación.

Resultados y conclusiones

Establecimiento de las condiciones de trabajo óptimas (separación espermática, protocolos de fecundación y sistemas de cultivo) para la utilización de semen sexado en la tecnología de producción de embriones in vitro.

El sistema ideal para la separación espermática está basado en la técnica de gradientes. En el caso particular del semen sexado, el volumen del gradiente empleado fue de 700 µL de Percoll al 90% + 700 µL al 45%. Los mejores resultados de fecundación se obtuvieron realizando el proceso en grupos de 20 ovocitos (máximo), y en una microgota de 20 µL de medio de fecundación (Fert-TALP), a la que se añadió un volumen de pellet del gradiente de otros 20 µL. Se sustituyó el medio Sperm-TALP empleado rutinariamente para los procesos de lavado por Fert-TALP, para evitar modificaciones de la composición final de la gota de cultivo.

La utilización de diferentes sistemas de cultivo (B2 sobre células Vero, fluido oviductal sintético -SOF- + 6 g/L BSA o SOF + 10% suero fetal bovino) no permitió mejorar la capacidad de desarrollo de los embriones producidos con semen sexado, que siempre fue significativamente inferior a la de su respectivo control no sexado (Tabla 1).

Análisis de la eficiencia del proceso de sexado

Se abordó la puesta a punto de un protocolo de PCR válido para el análisis del sexo de los embriones producidos. Para ello, se comparó la eficacia de la proteinasa K frente al choque térmico en la extracción de ADN en embriones bovinos. El uso del cebador de la amelogenina fue eficaz después del choque térmico y no tras el tratamiento con proteinasa K. BRY4a/SAT1 dio mayores tasas de falsos negativos cuando se utilizó en los embriones fecundados con eyaculado macho, indistintamente del método de digestión utilizado.

Análisis de la supervivencia a la criopreservación de los embriones producidos in vitro con semen sexado.

La supervivencia a la vitrificación de los embriones producidos in vitro con semen separado por citometría de flujo, fue comparable a la de su control producido con semen convencional. Tampoco se detectaron diferencias entre los sexos.

Estudio de la fertilidad de los embriones producidos in vitro con semen sexado, en fresco y tras criopreservación.

Los embriones producidos con semen sexado dieron lugar a porcentajes de gestación del 63%, en el caso de la transferencia de embriones frescos, y del 40% tras la transferencia de embriones vitrificados/desvitrificados.

Se han producido los primeros terneros en España resultantes de la transferencia de embriones producidos con semen separado, en fresco y tras vitrificación/desvitrificación (Fig 1).

Tabla 1. Desarrollo de embriones producidos in vitro con semen sexado y su control no sexado, y cultivados en B2 sobre células Vero, en SOF+6g/L BSA o en SOF+ 10% FCS.

x,y: p<0.005. a,b,c p<0.01; R: réplicas. N: zigotos

Fotografía 1. Sari ha sido la primera ternera nacida en España tras la transferencia de un embrión producido in vitro con semen sexado, vitrificado/desvitrificado. © SERIDA.

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