Equipo investigador
Ana J. González Fernández. SERIDA
Mª Carmen Mendoza Fernández. Universidad de Oviedo
Mª Rosario Rodicio Rodicio. Universidad de Oviedo (Asesora)
Ana Mª Fernández Sanz. INIA (Becaria)
Mateo San José. Universidad de Oviedo (Becario)
Entidad Colaboradora
Universidad de Oviedo
En la última década se ha producido un incremento en los daños causados por bacterias en los cultivos más importantes del Principado de Asturias. Así, se ha registrado un importante aumento de la presencia de grasa en judía granja asturiana, causada por Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Éste y otros cultivos (lechuga, kiwi, distintas plantas ornamentales, etc.) se han visto afectados también por una variante atípica, altamente virulenta, de P. viridiflava y, alguno de ellos (principalmente el kiwi), por otras Pseudomonas fluorescentes. En octubre de 2007 se detectó, además, la presencia de Erwinia persicina en judía. Todo ello, nos ha llevado a plantear un proyecto cuyo objetivo general es profundizar en el estudio de las bacteriosis que afectan a cultivos de importancia económica en el Principado de Asturias. En el caso de las Pseudomonas fluorescentes nos centraremos en aspectos relacionados con la epidemiología molecular y la virulencia, mientras que en E. percisina, al ser un patógeno poco conocido, abordaremos su epidemiología, identificación y caracterización fenotípica y genotípica. Finalmente, se llevará a cabo la puesta a punto de métodos de inoculación en especies leñosas que esperamos nos abra un campo al estudio de la etiología de nuevas patologías observadas en el territorio asturiano.
Se analizaron 110 aislamientos de P. viridiflava que fueron tipificados bioquímica y genéticamente mediante macrorrestricción genómica-PFGE, detección de islas de patogenicidad y análisis plasmídico. Los aislamientos procedentes de kiwi fueron sometidos, también, a ribotipificación y análisis MLST (MultiLocus Sequence Typing). Todos ellos fueron altamente diversos, tanto en sus características fenotípicas como en las genéticas.
En cuanto a la detección de islas de patogenicidad, hay que destacar que el 78,2% de los aislamientos fueron portadores de S-PAI y el 21,8% restante de T-PAI. La distribución de ambos tipos de isla, teniendo en cuenta el hospedador, mostró diferencias significativas en los casos de kiwi y judía.
La presencia de plásmidos en estos 110 aislamientos fue muy escasa, pues sólo ocho portaban plásmidos de entre 35 y 70 kb, aproximadamente. La relación entre plásmidos se estableció mediante digestión con diferentes endonucleasas (EcoRI, HindIII y BamHI) e hibridación utilizando el método de Southern. Así, se detectaron seis plásmidos diferentes, que fueron caracterizados mediante clonación y posterior secuenciación. Hasta el momento, se ha completado la secuencia de los plásmidos p1274 de 35 kb y p1206 de 70 kb, y se dispone de la secuencia parcial de p366 de 55 kb y de p150 de 35 kb.
Se analizaron las bacterias fitopatógenas presentes en las especies que acompañan al cultivo, estudiándose sus características fenotípicas, genotípicas y patogénicas para determinar si son las mismas cepas que se encuentran en la judía y si son patógenas para esta especie. A lo largo del período de estudio (2007-2009), se analizaron 134 muestras diferentes de malas hierbas, de las que se obtuvieron un total de 670 aislamientos, lo que supone una media de cinco bacterias diferentes en cada muestra. De los aislamientos obtenidos, 113 corresponden a especies consideradas fitopatógenas (aproximadamente el 17%).
P. s. pv. phaseolicola se había encontrado previamente en tres especies de malas hierbas en campos de cultivo de judía tipo granja asturiana, y durante el transcurso de este proyecto se encontró en otras dos más que son Sonchus oleraceus y Fumaria sp. En muestras de malas hierbas se aislaron, asemás, otras bacterias fitopatógenas como son P. s. pv. syringae, P. viridiflava, Erwinia persicina, Pantoea ananatis, Peptobacterium, Clavibacter, Rathayibacter y Curtobacterium flaccumfaciens.
Entre las no patógenas de judía, las más frecuentemente aisladas han sido Bacillus, entre las gram positivas, y Pseudomonas reactans entre las gram negativas.
Los 57 aislamientos de P. s. pv. phaseolicola obtenidos (52 de plantas de judía sintomáticas y cinco de malas hierbas), se analizaron mediante macrorrestricción genómica-PFGE con las endonucleasas PmeI y SwaI. Se obtuvieron seis perfiles distintos, cuatro de ellos (P1, P2, P4 y P9) ya habían sido encontrados por San José et al. (2010), y otros dos (P30 y P31) son de nueva descripción. Los cinco aislamientos obtenidos de malas hierbas no difieren de los de judía, mostrando los perfiles mayoritarios P1 (cuatro aislamientos) y P2 (un aislamiento).
Se ha ensayado la patogenicidad de las cepas de P. s. pv. phaseolicola y P. viridiflava aisladas de malas hierbas en judía, y se ha visto que son patógenas sobre la judía. También, se ha testado la patogenicidad de P. s. pv. phaseolicola en S. nigrum y, en este caso, se ha comprobado que la bacteria no produce síntomas de enfermedad en la mala hierba.
Se caracterizaron 50 aislamientos procedentes de varios hospedadores, incluidas las malas hierbas. Se realizaron pruebas bioquímicas y fenotípicas, específicas para Pseudomonas, y moleculares, como el ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis), la presencia de siringomicina y siringopeptina, la detección de genes productores de exopolisacáridos y de levanosacarasa. Los resultados muestran una alta variabilidad entre las cepas, lo que coincide con lo esperado al ser un grupo muy heterogéneo.
También, se tipificaron mediante MLST amplificando cuatro genes esenciales para el funcionamiento celular (genes housekeeping): 1) ADN ribosomal 16S, 2) rpoD, 3) gyrB y 4) gltA. El análisis de los resultados se ha llevado a cabo con la ayuda del Dr. David Guttman, de la Universidad de Toronto, donde uno de los miembros de equipo investigador de este proyecto (Ana Mª Fernández) ha realizado una estancia de tres meses.
Para la identificación se ha utilizado la amplificación y secuenciación del ADNr 16S.
Se han realizado un mínimo de 13 pruebas fenotípicas a 39 aislamientos asturianos, y se ha visto que han presentado variabilidad en cuanto a los caracteres fenotípicos ensayados, de forma que se han identificado siete biotipos diferentes. Las pruebas en las que se observó variabilidad fueron la asimilación de eritritol, sorbitol, inositol y el crecimiento a 36º C.
Se ha podido, también, confirmar la presencia de la bacteria en la semilla de judía recogida en fincas afectadas por la enfermedad, al contrario que en semilla de judía verde procedente del sudeste español (datos no publicados).
En cuanto a los posibles reservorios, conviene resaltar que se han analizado malas hierbas y se ha podido aislar la bacteria de muestras de Stellaria, Malva, Fumaria, Sonchus, Rumex, Solanum nigrum, Polygonum, Chenopodium, Juncia y otras tres especies no identificadas. Es importante destacar que la transmisión por insectos ya se había probado anteriormente (datos no publicados).
En cuanto a la caracterización patogénica de estos aislamientos, hay que señalar que se inocularon las cepas de E. persicina LPPA 489 y 505 y se comprobó que se reproducían los síntomas descritos para la enfermedad. Se inocularon, también, cepas de la bacteria E. rhapontici, muy próxima genéticamente a E. persicina, concretamente LPPA 569 procedente de una mala hierba sin identificar, LPPA 531, aislada de patata y LPPA 505, aislada de judía. Los síntomas que aparecieron fueron pequeñas manchas marrones, en el caso de la cepa LPPA 569, mientras que las otras dos no produjeron síntomas.
Se ha tomado como modelo la bacteria Curtobacterium flaccumfaciens y como controles negativos agua destilada estéril y otras bacterias no perjudiciales como Methylobacterium LPPA-2216. Se inocularon plantas de laurel mediante pulverización y heridas realizadas con bisturí impregnado en la bacteria, pero los resultados no han sido concluyentes puesto que enfermaron un 20% de las plantas inoculadas durante el primer mes.
Se realizaron, también, pruebas utilizando frutos inmaduros de laurel, peral y nogal, pero no se han conseguido resultados muy repetibles debido a la propia biota que acompaña a este material recogido en campo. Además, se inocularon vainas de judía de la variedad Helda mediante pinchazo con palillo estéril. Los resultados mostraron que no es un método válido para esta bacteria.