Resultado Proyecto
Potencial epizoótico de cepas de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis aisladas de ganado y de fauna silvestre
Referencia: FAU2008-00018-C02-02. Organismo financiador: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria. Importe: 18.956 €. Duración: 2008-2011.
Equipo investigador
José Miguel Prieto Martín SERIDA
Alberto Espí Felgueroso SERIDA
Rosa Casais Goyos SERIDA
Ana Balseiro Morales SERIDA
Marta Alonso Frenanadez NEIKER
José Francisco Ruiz Fons NEIKER
Equipo técnico
Paloma Solano Sobrado SERIDA
Justificación
Se trata de un proyecto coordinado entre el NEIKER y el SERIDA, cuyo objetivo estratégico consiste en comparar la virulencia y potencial de cepas de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) aisladas de diferentes hospedadores y localizaciones geográficas, mediante el análisis de su capacidad para replicar en modelos celulares de macrófagos bovinos y humanos y en una línea celular de jabalí. Los aislados bacterianos se ensayarán también en líneas celulares primarias de monocitos bovinos, así como en los aislados de jabalí y de gamo. Utilizando técnicas moleculares e inmunológicas, se evaluará la capacidad de las cepas estudiadas para sobrevivir en el interior del macrófago infectado, analizando la producción de citoquinas, expresión de antígenos de superficie e inducción de apoptosis. Los resultados de este estudio permitirán conocer si determinados genotipos de Map pueden ser rápidamente controlados y eliminados por ciertos hospedadores pero no por otros y posibilitarán el diseño de estrategias eficientes de control de la paratuberculosis, enfermedad que causa importantes pérdidas económicas en las explotaciones ganaderas.
Resultados y conclusiones
El primer paso del proyecto por parte del SERIDA fue la puesta a punto de un ELISA en gamos y vacas, que consistió en la preparación de dos tipos de antígenos de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) obtenidos por métodos físico-químicos; se fabricó un antígeno protoplasmático (A6) y otro proteico (A7). Se compararon con un antígeno comercial de Allied Monitor (PPA). Para poner a punto el método, se emplearon 42 sueros de gamo y 40 de bovino. Como pruebas de referencia se usó la histopatología y el cultivo. Los sueros de gamos se distribuyeron en siete animales con lesiones del tipo difusas con presencia de Map, 18 sueros procedentes de gamos con lesiones multifocales y focales sin presencia de Map y otros 17 procedentes de gamos sin ningún tipo de lesión. Los sueros bovinos pertenecían a un rebaño de vacas de la raza asturiana de la montaña (Figura 5), siete de ellas eliminadoras de Map por heces, que se usaron como controles positivos. Los anticuerpos secundarios fueron dos, un policlonal de conejo conjugado con peroxidasa (AG), realizado por nosotros, y uno comercial de proteína A-G de Pierce (PG). Los resultados muestran que los dos antígenos obtenidos producen unas densidades ópticas (DO) superiores a las obtenidas con la PPA comercial de bovino. El anticuerpo secundario AG produce una señal muy superior a la obtenida con la PG, especialmente cuando se utiliza el antígeno A6. La mayor sensibilidad y especificidad del ensayo se obtuvo con el antígeno A7 y con el anticuerpo secundario AG, siendo para los gamos la sensibilidad del 84 % y la especificidad del 76%, mientras que para las vacas fue del 92% y del 74%, respectivamente.
Por otro lado, se aislaron cinco cepas de Map procedentes de tejidos de gamos, y otras seis de tejidos y heces de bovino. Con una de las cepas de gamo, la G-89 se realizó un análisis de virulencia en una línea celular de macrófagos bovinos (BOMAC), analizándose el nivel de supervivencia de la bacteria en estas células y comparándola con otros aislados de ovino, caprino y bovino (análisis realizados en NEIKER). La cepa de gamo fue la que mostró la mayor tasa de crecimiento, el número de células viables intracelulares llegó a cuatro unidades logarítmicas, alcanzando unos títulos similares a las cepas de bovino a los siete días post- infección.
Se han tipificado, mediante PCR un total de 11 cepas de MAP (seis de bovino y cinco de gamo) utilizando cinco marcadores VNTR (variable-number tandem repeat). Los cinco loci VNTR utilizados fueron: 292, X3, 25 y 47. Con los tres primeros se encontraron diferencias en una de las cepas aisladas de gamo (la G-154), el resto de cepas presentaron el mismo patrón.
A la vista de los resultados, se concluye que las cepas de Map aisladas de gamo son muy similares a las aisladas de los bovinos, lo que podría suponer que existe interacción entre ambas especies. Esta hipótesis debe de ser confirmada en futuros estudios, analizando nuevas cepas que incluyan algunos aislamientos del agua y sedimentos de las charcas compartidas entre las especies, y estudiando el comportamiento animal mediante cámaras trampa.
En cuanto al diagnóstico serológico de Map mediante ELISA, es conveniente mejorar la especificidad del ensayo con la búsqueda de nuevos antígenos recombinantes, que a su vez podrían ser usados como potenciales vacunas.
Figura 1. Rebaño de vacas de raza Asturiana de la Montaña ubicado en invierno en Duyos (Caravia Alta) y que durante el periodo estival pastan en la Sierra del Sueve. Sobre estos animales se realizaron las pruebas de ELISA y se obtuvieron varias cepas de Map.