Resultado Proyecto
Aplicabilidad del método de “alta presión hidrostática” (HHP) en la mejora de la congelabilidad de ovocitos y embriones bovinos producidos in vitro con semen sexado
Referencia: RZ2008-00014. Organismo financiador: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria . Importe: 66.000 €. Duración: 2008-2011.
Equipo investigador
Carmen Díez Monforte. SERIDA
Enrique Gómez Piñeiro. SERIDA
Marta Muñoz Llamosas. SERIDA
Paloma Duque Álvarez. CEFIVA
Carlos Ochoa García del Fresno. CEFIVA
Equipo técnico
Susana Carrocera Costa SERIDA
Entidades Colaboradoras
Luis José Royo Martín. SERIDA
Csaba Pribenszky. Department of Animal Husbandry and Genetics, Faculty of Veterinary Sciences of Budapest (Hungría)
Justificación
El número de especies animales amenazadas y en peligro de extinción está creciendo de forma alarmante. Es, por tanto, necesario tomar nuevas medidas para preservar la variabilidad genética de las especies. La congelación de ovocitos y embriones de sexo conocido puede ser un medio efectivo de conservar las líneas germinales femeninas y de embriones, siendo, por ello, una herramienta fundamental para la conservación de poblaciones en peligro de extinción. La congelación de ovocitos y embriones producidos in vitro presenta limitaciones para su incorporación a los Bancos de Recursos Zoogenéticos (BRZs), dada su especial sensibilidad a los efectos de las bajas temperaturas. La producción in vitro y posterior congelación de embriones de sexo conocido persigue dotar a los BRZs de material adaptado a los efectivos poblacionales y a sus aptitudes. El presente proyecto estudia, por un lado, la utilización de la aplicación del sistema HHP para mejorar la congelabilidad de los ovocitos bovinos y los embriones producidos in vitro; y, por otro, el empleo de semen sexado bovino para la producción de embriones de sexo conocido destinados a ser incorporados a los BRZs.
Resultados y conclusiones
Criopreservación de ovocitos bovinos
El tratamiento de alta presión hidrostática (high hydrostatic pressure; HHP) produce un ligero aumento del tamaño del huso meiótico de los ovocitos, que se normaliza transcurrida 1 h (Fig. 1) después del tratamiento.
El tratamiento de HHP no afectó a la capacidad de desarrollo de los ovocitos tratados, que produjeron porcentajes de blastocistos (día 8) comparables en el grupo control y en el tratado con HHP.
Los embriones tratados con presión presentaron más células en el trofectodermo, con lo que el número de células totales fue también más elevado en estos embriones. Sin embargo, no se apreció efecto del tratamiento sobre el número de células de la masa celular interna (MCI), ni sobre la relación MCI/células totales.
Los niveles de Heat Shock Protein-70 y 90, uno de los posibles mecanismos a los que se atribuyen los efectos beneficiosos de la aplicación de la alta presión hidrostática, fueron similares en todos los grupos experimentales de ovocitos.
Ninguno de los tres sistemas de cultivo empleados (fluido oviductal sintético -SOF- + 6 g/L BSA, SOF + 10% suero fetal bovino, o cocultivo en células vero + B2) mejoró el desarrollo de los ovocitos vitrificados/desvitrificados tras su fecundación y posterior cultivo.
La aplicación de la HHP no contribuyó a la mejora de la capacidad de supervivencia de los ovocitos bovinos a la vitrificación.
Criopreservación de embriones bovinos producidos in vitro
El tratamiento de HHP no afectó al número de células y su distribución en los blastocistos tratados con relación al grupo control.
Los niveles de Heat Shock Protein-70 fueron similares en todos los grupos experimentales de embriones. El tratamiento de HHP no mejoró la supervivencia in vitro de los embriones tratados.
Los embriones tratados con HHP que eclosionaron a las 48h de la desvitrificación, mostraron un incremento de las células de la MCI, lo que podría indicar una mejora de la calidad embrionaria con relación a los embriones no tratados.
Producción de embriones bovinos de sexo conocido por medio de la utilización de semen sexado
El semen sexado ve significativamente reducida su fertilidad in vitro con relación a su respectivo control no sexado, y la capacidad de desarrollo in vitro de los embriones producidos con semen sexado no se ve afectada por el medio de cultivo empleado.
Los embriones producidos in vitro con semen sexado tienen la misma calidad que sus homólogos producidos con semen convencional en términos de número y distribución de su población celular, y de supervivencia in vitro a la vitrificación.
Los embriones producidos in vitro con semen sexado y transferidos en fresco a hembras receptoras, producen tasas de gestación elevadas (63%) y el nacimiento de terneros normales. Los embriones producidos in vitro con semen sexado y transferidos a receptoras tras vitrificación/desvitrificación, producen tasas de gestación del 40% y el nacimiento de terneros normales, aunque son necesarias más transferencias para confirmar estos datos.
Fig 1. Imágenes de microscopía de luz polarizada correspondientes a un ovocito control (Control NO TRATADO), a un ovocito sometido a tratamiento HHP sin recuperación posterior (HHPt NO rec) y un ovocito tratado con presión e incubado en medio de maduración durante 1 h después del tratamiento (HHPt 1h rec).