Equipo investigador
Isabel Feito Díaz SERIDA
Marta Ciordia Ara SERIDA (Alta 2009)
Belén Fernández Muñiz Universidad de Oviedo
Ana Rodríguez Alonso Universidad de Oviedo
Ricardo Ordás Fernández Universidad de Oviedo
Juan Pedro Majada Guijo SERIDA / CETEMAS
Entidades Colaboradoras
Institut National de la Recherche Agronomique. INRA. (Francia)
Centre National de la Recherche Scientifique. CNRS. (Francia)
Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement. CIRAD. (Francia)
AFOCEL BIOTECH. (Francia)
Instituto de Investigação da Floresta e Papel. RAIZ. (Portugal)
Eficiencia en el uso del agua y contenido de ácido abscísico (ABA) en un clon tolerante a sequía de Eucalyptus globulus Labill.
Se ha llevado a cabo una caracterización completa del clon C14 de E. globulus, en situación de déficit hídrico a largo plazo (3 meses). Para ello, se analizaron parámetros fisiológicos (relacionados con la fotosíntesis y las relaciones hídricas), químicos (C13) y hormonales (ABA) en plantas sometidas a estrés y plantas control. El ABA se cuantificó mediante una modificación del método de Dobrev y Kaminek (2002) en segmentos apicales de raíces y tallos y en muestras directas de xilema, por radioinmunoensayo (RIA) utilizando anticuerpos policlonales (anti-ABA) (C4´) específicos de la forma libre y activa de la molécula de ABA. Los anticuerpos fueron desarrollados por nuestro grupo en colaboración con la Universidad de León. Los datos fueron validados mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-ESI-MS).
Los resultados indican que la biomasa aérea de las plantas estresadas de este clon no varía con respecto al control, pese a reducir el tamaño de las hojas a lo largo del estrés. El contenido de clorofilas y los parámetros fotosintéticos se redujeron drásticamente, el contenido de ABA aumentó 4,3 veces pero la discriminación isotópica (C13) fue similar en las plantas control y estresadas. Los datos obtenidos sugieren que este clon mantiene el crecimiento durante situaciones de estrés muy severo, a costa de su propia supervivencia.
Caracterización fisiológica del clon tolerante a sequía y construcción de librerías sustractivas para el carácter tolerancia a estrés hídrico en E. globulus
Los mecanismos de respuesta temprana al estrés del clon C14, que permiten un crecimiento continuado durante la situación de déficit hídrico, se estudiaron mediante un sistema experimental en cultivo hidropónico, desarrollado por nuestro grupo y que se basa en la inducción de un estrés severo en las raíces. Para simular el estrés hídrico, se utilizó polietilenglicol 8000 (PEG) como agente osmótico inocuo. Los resultados obtenidos resaltan el importante papel que juegan en la señalización temprana del estrés hídrico, tanto el contenido de ABA en el xilema como los cambios de pH xilemático El máximo contenido en ABA en los tejidos analizados se observó después de 24 h de estrés constante, existiendo una relación significativa entre los niveles de ABA y los valores obtenidos para los parámetros fisiológicos e hídricos. Estos resultados destacan el ABA como un excelente marcador fisiológico de “resistencia/tolerancia” para el carácter sequía, por lo que se utilizó como señal para los análisis moleculares.
Teniendo en cuenta la concentración del ABA, se recogió el material vegetal para la construcción de librerías de genes mediante hibridación sustractiva selectiva (SSH). Tras la extracción de ARN, se realizaron mezclas equimolares para conformar dos poblaciones de ARN, estrés y control, para construir las librerías. Se utilizaron dos clases de explantos en cada toma de muestras: segmento apical del tallo (incluyendo brote apical y primer par de hojas) y el segmento apical de la raíz.
Para la construcción de las librerías SSH, se seleccionaron al azar 960 fragmentos de cADN, tanto para tallo como para raíz. Finalmente, se obtuvieron 778 secuencias únicas y válidas de tallo (GenBank Accn: GO247708-GO248485) y 558 de raíz (GenBank Accn: GW337401-GW337958). Para cada librería se seleccionaron 40 posibles genes candidatos relacionados con el ABA, con otras hormonas (citoquininas, ácido indolacético) osmoprotectantes y estrés oxidativo. Pese a la existencia de algunas diferencias en el patrón de expresión de estos genes, los resultados obtenidos, hasta el momento, no permiten la elección de ninguno de estos genes como genes candidatos de confianza, por lo que en este momento se está llevando a cabo un ensayo de genes candidatos basado en la bibliografía de estrés hídrico.
Estudios de la respuesta temprana a nivel proteómico del clon C14 frente al estrés hídrico
En colaboración con el INRA (Francia) se realizó un estudio proteómico tomando como base la curva de ABA.
Los estudios realizados a nivel de tallo no mostraron diferencias en la expresión proteica, pero si a nivel de raíz. De los 406 “spots” reproducibles, se observaron 34 diferentes en función del tratamiento (estrés vs control) y su duración (3 vs 36 h). La caracterización por espectrometría permitió identificar proteínas como la adenosina kinasa, la actina y moléculas relacionadas con el estrés y con distintos procesos celulares.