Resultado Proyecto

Regulacion de la proliferación celular en la masa celular interna del blastocisto bovino por retinoides

Referencia: AGL2005-04479/GAN. Organismo financiador: Ministerio de Ciencia e Innovación. Importe: 121.380 €. Duración: 2005-2008.

Equipo investigador

Enrique Gómez Piñeiro SERIDA
Carmen Díez Monforte SERIDA
Marta Muñoz Llamosas SERIDA
José Néstor Caamaño Gualdoni SERIDA
Aida Rodríguez Pérez MICINN (Becaria)

Investigadores en colaboración

José Manuel Prendes García Cooperativa de Agricultores (Gijón)
Paloma Duque Álvarez CEFIVA (Gijón)
María Álvarez Viejo HUCA (Oviedo)
Keith Campbell Universidad de Nottingham (Reino Unido)

Entidades Colaboradoras

Asturiana de Control Lechero S.C.L. (ASCOL)
Cooperativa de Agricultores del Concejo de Gijón (CAGI)
Centro Intercooperativo del Campo de Asturias (CICA)
Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA)
Centro de Fertilización In Vitro de Asturias (CEFIVA)

Avance de resultados

En este proyecto se pretendió identificar mecanismos moleculares que permitan producir embriones bovinos cultivados in vitro con más células en su masa celular interna (MCI). De esta manera, se estima que estos embriones producirán mejores índices de gestación y la derivación de células troncales embrionarias será más efectiva. El proyecto incluyó el estudio de los retinoides (derivados de la vitamina A; retinol) en la diferenciación del embrión y la puesta a punto de sistemas de producción y cultivo de células troncales embrionarias bovinas (CTEB). Las CTEB son altamente susceptibles a modificaciones genéticas y su uso en aplicaciones ganaderas pueden ser de elevado valor biotecnológico. Hasta el momento, no se conocen sistemas de cultivo de CTEB eficientes en el ganado bovino.

El cultivo de mórulas con ácido all-trans-retinoico (ATRA), ligando específico de los receptores del ácido retinoico (RAR), mejoró la calidad y el desarrollo de los embriones cultivados con albúmina, sin necesidad de suero. El estudio se realizó comparando la activación del receptor RAR contra el receptor X de los retinoides (RXR), usando el agonista sintético LG100268 (LG). La apoptosis aumentó significativamente con LG, al contrario que con ATRA y en embriones no tratados. El tratamiento con ATRA mejoró la supervivencia a la vitrificación. Tanto LG como ATRA activaron genes relacionados con la apoptosis (como el gen Bax) y con el ciclo celular (histona H2A.Z). Sin embargo, otro gen apoptótico se activó sólo en presencia de ATRA (p53) y no de LG. La expresión de p53 y de H2A.Z mostró una fuerte correlación (0,93; p<0.0001) lo que sugiere una nueva vía de control de p53 sobre el ciclo celular. Al igual que los receptores RAR, la estimulación de los RXR puede utilizarse para regular la proliferación celular y aumentar la viabilidad de los blastocistos bovinos.

Los embriones producidos con ATRA se sometieron a vitrificación (un sistema de criopreservación). Los efectos de la vitrificación son críticos para la MCI del embrión, mientras que el trofectodermo es resistente. El ácido retinoico no evita los efectos perjudiciales de la vitrificación sobre la MCI. En un estudio en colaboración con la Universidad de Murcia (Departamento de Reproducción Animal) se comprobó que, también, en ganado porcino la presencia de ácido 9-cis-retinoico durante la maduración aumenta los índices de producción de blastocistos.

Otro estudio indicó la necesidad de contar con proteínas de origen bovino para el cultivo de embriones y CTEB. El cultivo de mórulas in vitro con el factor inhibidor de la leucemia (LIF) produjo resultados contradictorios entre el LIF humano (mayor homología con el bovino) y el LIF murino. En cualquier caso, ninguno de los efectos sobre el desarrollo y la calidad de los embriones producidos fue comparable al obtenido por otros autores en presencia de LIF bovino recombinante (no disponible comercialmente).

En células troncales, la investigación se orientó hacia la exploración de nuevas rutas de señal intracelular para el mantenimiento de la indiferenciación y la auto-renovación celular, algo básicamente desconocido en bovino. Se pusieron a punto técnicas de activación de ovocitos bovinos para producir células embrionarias partenogenéticas. Estas células tienen gran capacidad para colonizar la gónada en la producción de quimeras y sus aplicaciones en biotecnología son del mayor interés. Tanto los blastocistos fertilizados como los partenogenéticos presentaron expresión de proteínas de receptores de tirosina-quinasa (TrkA, TrkB, TrkC y p75NTR) asociados a la proliferación celular. Las líneas CTEB partenogenéticas se pudieron caracterizar por la expresión de varios marcadores de pluripotencia (Nanog, SSEA4, TRA-1-81 y TRA-1-60; véase figura 1) cuya utilidad en bovino hemos puesto en discusión. Igualmente, se identificó la proteína Interferon-Tau (I-Tau) en embriones in vitro, en partenotes y en CTEB derivadas de embriones (obtenidos de hembras vivas y también producidos in vitro) y de partenotes. I-Tau es la molécula de origen embrionario que señala la presencia del embrión a la madre. Los partenotes bovinos presentaron menos células en el trofectodermo que los embriones, pero igual número de células en la MCI. Se aportaron evidencias de que los mecanismos de inhibición del crecimiento y apoptosis difieran entre embriones y partenotes (a través de p53 y p66^shc, respectivamente).

Se obtuvieron líneas celulares embrionarias bovinas a partir de la masa celular interna de blastocistos producidos in vitro e in vivo y cultivadas en fibroblastos. La morfología de las líneas es la propia de células troncales. Se realizaron hasta ocho pases en dos líneas, las cuales se congelaron, descongelaron y cultivaron nuevamente. En los embriones producidos in vitro, se analizó la expresión inmunohistoquímica de marcadores de pluripotencia (nanog, Oct-4, fosfatasa alcalina; SSEA4; TRA-1-81 y TRA-1-60) y otros específicos de tejidos (cytokeratin; actin α 2 smooth muscle aorta; tubulin β3). La aplicaciσn a bovino de algunos de los marcadores de pluripotencia utilizados en otras especies es cuestionable.

Figura 1. Diversos marcadores indicativos de pluripotencia en células embrionarias bovinas (fila superior) y embriones bovinos (fila inferior)