Resultado Proyecto

Valoración no invasiva de la viabilidad de ovocitos de especies domésticas por Microscopia de Luz Polarizada

Referencia: RZ2007-00013-00-00. Organismo financiador: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria. Importe: 38.461 €. Duración: 2007-2010.

Equipo investigador

José Néstor Caamaño Gualdoni. SERIDA
Enrique Gómez Piñeiro. SERIDA
Carmen Díez Monforte. SERIDA
Marta Muñoz Llamosas. SERIDA
Emilio Martínez García. Universidad de Murcia
María Antonia Gil Corbalán. Universidad de Murcia
Cristina Cuello Medina. Universidad de Murcia

Entidades Colaboradoras

Laboratorio de Fertilización In Vitro. Facultad de Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona.
Facultad de Veterinaria. Departamento de Medicina y Cirugía Animal. Universidad de Murcia.

Avance de resultados

Objetivo 1.

Determinación de la presencia del huso meiótico y el estado de maduración en ovocitos de las especies bovina, porcina, ovina y caprina.

Se evaluó la eficiencia de la microscopia de luz polarizada (MLP) para detectar proteína polimerizada (tubulina) que podría conformar un huso meiótico en ovocitos de las cuatro especies animales estudiadas. Para confirmar la presencia de la proteína polimerizada y del huso meiótico, cada ovocito se evaluó de forma individual y, mediante análisis inmunocitoquímico, se detectó el huso meiótico. En todas las especies estudiadas se observó correlación positiva entre la señal obtenida por MLP y la presencia de proteína polimerizada por inmunocitoquímica (bovinos: r=1, p<0.0001; porcino: r=1, p<0.0001; ovino: r=0.87, p<0.001; caprino: r=1, p<0.001). Un huso meiótico normal (forma de barril - barrel-shape spindle) se confirmó en el 96.7%; 92.9%; 77.3% y 92.0%  de los ovocitos en MII en bovino, porcino, ovino y caprino, respectivamente (Figura 1).

Cabe concluir lo siguiente:

• MLP es un método eficiente para detectar proteína polimerizada-microtúbulos en ovocitos de las cuatro especies estudiadas.
• Las imágenes obtenidas por MLP muestran alta correlación con las obtenidas por inmunocitoquímica del huso meiótico.
• MLP no sería un método adecuado para valorar la conformación del huso meiótico, en particular los cromosomas.

Objetivo 2.

Evaluar el uso de la microscopia de luz polarizada para determinar la viabilidad de ovocitos madurados  in vitro en las especies bovina y porcina.

Bovino: Los ovocitos se expusieron a luz polarizada 10 minutos y luego se fertilizaron in vitro. Los ovocitos expuestos a MLP no mostraron diferencias significativas en el porcentaje de división celular a las 72 horas (81.9 ± 4.0 vs. 74.6 ± 4.0), y la proporción de blastocistos en día 7 (29.6 ± 4.7 vs. 30.3 ± 4.7) y día 8 (34.4 ± 4.9 vs. 33.3 ± 4.9) comparado con el grupo control no expuesto. Asimismo, tampoco se encontraron diferencias en el número de células del macizo celular interno, trofoectodermo y número total de células.

Porcino: Los ovocitos se expusieron a la luz polarizada 10 minutos y luego se sometieron a activación partenogenética. Los expuestos a MLP no mostraron diferencias significativas en el porcentaje de divisiones celular (83.7 ± 1.5 vs. 84.4 ± 1.5),  y proporción  de blastocistos (36.9 ± 3.6 vs. 41.2 ± 3.6) y blastocistos expandidos (21.9 ± 1.7 vs. 26.2 ± 1.7) en día 7 comparado con el grupo control no expuesto. Tampoco se encontraron diferencias en el número de células totales en los blastocistos expandidos.

En otro experimento, se seleccionaron y separaron ovocitos porcinos con señal positiva a la MLP (MLP+), señal negativa (MLP-) y un grupo control sin seleccionar. Tras fertilización in vitro, el porcentaje de penetración, fertilización monoespérmica y eficiencia de la fertilización no difirió significativamente entre grupos. Sin embargo, el porcentaje de ovocitos que llegaron a MII fue inferior en el grupo MLP-, comparado con el grupo control y MLP+. No se observaron diferencias entre grupos en divisiones celulares a las 48 horas. Sin embargo el porcentaje de blastocistos en día 7 del grupo MLP- fue inferior.

Cabe concluir lo siguiente:

• La MLP no es deletérea para el desarrollo in vitro de los ovocitos bovinos y porcinos.
• La selección de ovocitos porcinos por MLP se traduce en una mejora moderada de los porcentajes de blastocistos.

Objetivo 3.

Evaluar el uso de la microscopia de luz polarizada como método de selección de ovocitos antes de la criopreservación y después de la descongelación en bovinos.

Se vitrificaron ovocitos bovinos por el método de “Solid Surface Vitrification” (SSV). Tras un período de almacenamiento en nitrógeno líquido, los ovocitos fueron calentados y evaluados por MLP para analizar la reconstrucción del huso meiótico post-vitrificación. A continuación, los ovocitos, de acuerdo con su señal MLP, se clasificaron en cuatro grupos que se activaron partenogenéticamente: 1. Calentados-MLP+; 2. Calentados-MLP-; 3. Calentados sin seleccionar; 4. Control ovocitos frescos.

Se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de divididos a las 48 horas (52.8 ± 6.8 vs 17.1 ± 6.8) y en la proporción de blastocistos totales de día 8 (20.4 ± 3.6 vs. 3.5 ± 3.6) entre el grupo de ovocitos calentados-MLP+ y el grupo calentado-MLP-, respectivamente.

Como conclusión más relevante, cabe señalar :

• En ovocitos bovinos vitrificados y posteriormente calentados, aquellos que son capaces de reconstruir el huso meiótico, presentan un desarrollo superior a sus homólogos donde no se aprecia el huso meiótico.

Figura 1. Evaluación de ovocitos de especies domésticas con el equipo de microscopía de luz polarizada.