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Desarrollo de un método de criopreservación para la transferencia directa de embriones bovinos producidos in vitro
Referencia: RTA2011-00090-00-00. Organismo financiador: Ministerio de Ciencia e Innovación. Importe: 79.952 €. Duración: 2011-2014.
Equipo investigador
Carmen Díez Monforte. SERIDA
José Néstor Caamaño Gualdoni. SERIDA
Beatriz Trigal Triguero. SERIDA
Paloma Duque Álvarez. CEFIVA
Carlos Ochoa García del Fresno. CEFIVA
Equipo técnico
Susana Carrocera Costa. SERIDA
Avance de resultados
El presente proyecto abordó el estudio y optimización de dos sistemas de criopreservación (congelación y vitrificación) para la conservación de embriones bovinos producidos in vitro (EPIV), con el objetivo de poner a disposición del sector ganadero una nueva herramienta reproductiva que permitirá optimizar el rendimiento de los cruces entre animales selectos.
1) Establecimiento de un sistema de criopreservación de EPIV para transferencia directa en granja.
Los resultados obtenidos demostraron que los EPIV vitrificados se pueden calentar en un paso único, en presencia de sacarosa 0'25 M, sin que su viabilidad posterior se vea afectada. Este primer resultado, condición imprescindible para la transferencia directa de los embriones vitrificados, permitió abordar una segunda fase experimental en la que se ensayaron dos nuevos métodos de vitrificación/calentamiento, basados en el sistema CVM (control), y en los que se modificó, bien el soporte utilizado para la vitrificación (fibreplug), bien el procedimiento de calentamiento. Los resultados de supervivencia in vitro fueron, en los dos casos, similares a los del grupo control; sin embargo, el primero de los métodos experimentales presentó dificultades de manejo de los embriones, y el porcentaje de embriones que se perdieron fue del 26%, una cifra no aceptable para esta técnica. Contrariamente, en el segundo sistema, el porcentaje de embriones extraviados durante el calentamiento se redujo al 3,5%, lo que abre la posibilidad de aplicar el método en la granja, para la transferencia directa de los embriones.
2) Análisis in vitro e in vivo de la supervivencia de los EPIV y congelados o vitrificados.
Aunque no se obtuvieron diferencias en la capacidad de desarrollo post-calentamiento o post-descongelación, los embriones vitrificados que eclosionaron tras el calentamiento y posterior cultivo tuvieron un número de células significativamente más alto que los congelados/descongelados, apuntando hacia una mayor calidad (Tabla 1). Además, la congelación incrementó los índices de apoptosis en el embrión, tanto en el trofectodermo, como en la masa celular interna (y consecuentemente, también en el total de células del embrión) (Tabla 2). El protocolo de criopreservación no afectó a los índices de necrosis, que fueron similares tras vitrificación o congelación. Por lo tanto, se puede concluir que, en nuestras condiciones de trabajo, la vitrificación es el método de elección para la criopreservación de EPIV. Se han realizado transferencias de embriones frescos (n=13) y vitrificados (n=14) a receptoras. Se esperan los resultados definitivos de gestaciones en los próximos meses.
Tabla 1. Supervivencia in vitro de embriones bovinos producidos in vitro vitrificados o congelados, y células totales de los embriones eclosionados.
| Grupo | R | N | Re-exp 2h |
Re-exp 24h |
Eclosión 24h |
Eclosión 48h |
R | N | Total Células |
| Vitrificación | 6 | 337 | 95.4±4.9 | 94.5±4.9 | 20.6±7.0 | 53.6±10.2a | 3 | 175 | 143.5±12.7a |
| Congelación | 5 | 381 | 94.1±4.9 | 92.6±4.9 | 21.0±7.0 | 32.5±10.2b | 3 | 106 | 106.1±9.6b |
| Índices diferentes en la misma columna, representan diferencias significativas (p<0.05); R: réplicas; N: embriones cultivados; Re-exp: blastocistos reexpandidos. | |||||||||
Tabla 2. Índices de apoptosis y necrosis en blastocistos eclosionados tras vitrificación o congelación.
| N | Total | APO/MCI | APO/TE | Necr/MCI | Necr/TE | |
| Vitrificación | 27 | 168.41±7.2a | 6.60±1.6a | 2.81±0.7x | 10.40±1.8 | 4.61±0.7 |
| Congelación | 47 | 135.78±5.3b | 13.14±1.2b | 5.02±0.5y | 11.24±1.3 | 5.34±0.5 |
| Índices diferentes en la misma columna, representan diferencias significativas: a, b: p<0.001; x, y: p<0.005; N: embriones cultivados. APO: núcleos apoptóticos; Necr: núcleos necróticos; MCI: total núcleos en masa celular interna; TE: total núcleos en trofectodermo | ||||||
3) Análisis del efecto de la cinética de desarrollo sobre la supervivencia in vitro a la criopreservación de los EPIV.
La velocidad de desarrollo del embrión es un criterio asociado a su calidad. En este trabajo se vitrificaron o congelaron EPIV previamente seleccionados por su cinética de desarrollo (estadio 48h post FIV), y se analizó su supervivencia in vitro. El análisis agrupado de los datos de supervivencia (vitrificación+congelación), permitió comprobar que la cinética de desarrollo no tuvo efecto sobre la supervivencia a la criopreservación. Sin embargo, el análisis individual permitió concluir que, en el caso de la vitrificación, la mayor velocidad de desarrollo no va siempre asociada a una mejor supervivencia a la vitrificación (Fig 1) (datos pendientes de publicación).
Fig 1: Tinción diferencial de blastocisto de desarrollo lento (3-4 células en día 2), tras vitrificación/calentamiento.